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来源:《常见和新发传染病动物模型》
1.病毒及攻毒 Zaire亚型豚鼠适应株,攻毒剂量为10的3.8次方pfu/0.5ml PBS,右上肢内侧皮下注射。
2.实验动物 SPF级strain-13成年豚鼠。
3.实验环境 BSL-4级实验室。
4.实验步骤 每天观察动物的一般状况,包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况。攻毒后每天称重1次,攻毒后1~5、7、9d每天安乐相同数量的豚鼠(3只左右),取血及如下组织:淋巴结(包括下颚、腋下、肠系膜、及膝后窝部)、纵隔膜、脾、肝、肺、心、脑、肾、舌、胃、食管、气管、小肠、盲肠、结肠、膀胱、生殖系统、扁桃体、唾液腺、胸腺、胰腺、甲状腺、肾上腺及骨髓。同时设立未攻毒豚鼠对照。
5.病毒分离 解剖时取如上组织,研磨处理后接种Veto细胞,每天观察细胞病变。
6.病毒RNA的检测 取如上组织放入1ml裂解液(Qiagen)中,用研磨器充分研磨,离心后取上清放入buffer RLT(已加入1%巯基乙醇)350μl,4℃,13000转/分离心3min,将上清转移至新1.5ml微量离心管中。提取样品病毒核酸,再将RNA反转录成cDNA,通过荧光定量PCR仪直接测定病毒核酸载量。
7.病毒抗体检测 动物在不同时间点处死采血分离血清,-80℃下保存备用,用特异性ELISA试剂盒对抗体进行检测。
8.病理观察 解剖时取如上组织,详细观察各组织的形态变化,并将各组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,HE方法染色后,镜检观察。
9.建模结果 豚鼠约5d后开始出现不进食、发热、脱水等临床症状,8~11d后无一例外的死亡,但并不伴随出血的现象。肝和脾中可于攻毒后2d检测到病毒,3d时病毒扩散至肾、肾上腺、肺及胰腺,随后组织平均病毒效价逐步上升并于9d时达到峰值(图14-11、图14-12、图14-13和图14-14),病毒血症于7d时达到近100 000pfu/ml的峰值。感染的豚鼠同时还逐渐出现凝血时间(prothrombin time, PT)延长等现象。
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