蛋白质的检测在生物化学、分子生物学和医学诊断中是一项基础且关键的技术。通常根据不同的目的（如定性、定量、定位、功能分析），检测蛋白质的方法也有很多种。本文通过介绍几种常用的蛋白质检测方法，带你熟悉了解蛋白质的检测手段。
什么是蛋白质？
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。是构成生命体重要的物质。
蛋白质的性质
• 理化性质
蛋白质是两性物质，其分子中存在氨基（N-端）和羧基（C-端）。
• 盐析
添加高浓度中性盐溶液等能够降低蛋白质溶解度，使其不改变原先的性质而析出的现象。
• 变性
经过热、酸、碱或紫外和重金属作用下使蛋白质产生不可逆的变化而失去原有的功能和活性。
蛋白质的常用检测方法
01，用于测定溶液中蛋白质的总浓度，快速、简便，但通常不能区分不同种类的蛋白质。
| 检测方法 | 原理 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
| 紫外吸收法 | 蛋白质中的色氨酸和酪氨酸残基在280nm处有强吸收峰。利用标准曲线或经验公式（1 OD280 ≈ 1 mg/mL）可估算浓度。 | 快速、无损、样品可回收 | 受蛋白质特异性氨基酸组成影响大；核酸在280nm也有吸收，会干扰测定。 | 初步、快速估算较纯蛋白质样品的浓度。层析时洗脱峰的实时监测。 |
| Bradford法 | 考马斯亮蓝在酸性条件下与蛋白质疏水区结合，由红棕色转为蓝色，在595nm处测吸光度 | 快速、灵敏、干扰物较少 | 不同蛋白质响应值有差异；高浓度去垢剂会干扰 | 常规细胞裂解液、较纯蛋白样品的快速定量。实验室日常方法 |
| Lowry法 | 分两步：蛋白质在碱性溶液中与铜离子反应（双缩脲反应），生成铜-蛋白质复合物，此复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂），产生深蓝色。 | 灵敏度高于紫外法 | 步骤繁琐；受多种物质（如Tris、蔗糖、EDTA等）干扰严重 | 目前使用较少，主要在历史方法或特定无干扰体系中 |
| BCA法 | 类似于Lowry法，蛋白质在碱性条件下将Cu²⁺还原为Cu⁺，BCA试剂与Cu⁺结合形成紫色络合物，在562nm处检测 | 灵敏度高，抗干扰能力强（对去垢剂兼容性好），操作简便 | 不同蛋白质的响应仍有差异 | 含有去垢剂的复杂样品（如细胞、组织裂解液）的准确定量。需要高灵敏度的场景 |
02，特定蛋白质的定性与定量分析，能够检测混合物中特定的目标蛋白。
| 检测方法 | 原理 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
| SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳） | SDS使蛋白质带上均匀的负电荷，电泳时迁移率仅取决于分子量大小。 | 分离能力强：按分子量分离混合物。可定性评估纯度、分子量。成本低 | 只能半定量（染色强度）。不能鉴定蛋白质。通量低 | 分析蛋白质样品纯度、分子量估计。Western Blot和质谱分析的前置步骤。 |
| 酶联免疫吸附测定（ELISA） | 将抗原或抗体固定在固相表面，通过酶标记的抗体进行反应，加入底物后显色，颜色深度与目标蛋白量成正比。 | 高特异性与高灵敏度。可绝对定量（有标准曲线）。高通量：适合处理大量样本（96/384孔板）。操作相对标准化。 | 需要配对的高质量抗体（夹心法）。无法提供分子量信息。 | 体液中（血清、培养上清）特定蛋白的高通量、精确定量。临床诊断和药物研发的核心技术。 |
| Western Blot（蛋白质免疫印迹） | 将样品通过SDS-PAGE电泳按分子量分离，然后转印到膜（如PVDF、NC膜）上，用特异性抗体进行孵育和显色 | 高特异性：抗体决定特异性。提供多重信息：存在性、分子量（翻译后修饰）、半定量。灵敏度高（皮克级） | 操作复杂、耗时（1-2天）。定量线性范围窄，为半定量。高度依赖抗体质量（特异性、效价）。通量较低。 | 确认特定目标蛋白的存在、分子量改变（如剪切、糖基化）及在复杂样本中的相对丰度。科研中的金标准 |
| 免疫沉淀与免疫共沉淀 （IP/Co-IP） | 免疫沉淀与免疫共沉淀（IP/Co-IP） | 能从复杂混合物中富集目标蛋白。可研究蛋白互作（Co-IP）。下游分析灵活（WB, MS） | 非生理条件：可能捕获假阳性互作。背景可能较高。对弱互作捕获效率低。 | 富集低丰度蛋白、验证或发现蛋白质-蛋白质相互作用 |
03，用于蛋白质的鉴定和结构的分析等精确质量的测定。
| 检测方法 | 原理 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
| 质谱（MS） | 将蛋白质酶解成肽段，根据蛋白质/肽段的疏水性、电荷、大小等特性进行分离 | 金标准：可准确鉴定未知蛋白质。超高分辨能力：可分析翻译后修饰（磷酸化、糖基化等）。高通量：一次实验可鉴定数千种蛋白质 | 仪器极其昂贵，操作复杂。前处理要求高。定量复杂，动态范围有限（高丰度蛋白易掩盖低丰度蛋白）。不能直接分析活性 | 蛋白质组学、未知蛋白鉴定、翻译后修饰谱分析、生物标志物发现。 |
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